免疫組化染色沒有出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果時，應(yīng)系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。
對照/標本無染色
① 確認是否忽略了應(yīng)該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 確認所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。
③ 對照抗體的標簽確認是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。
⑤ 檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標記了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融，試劑保存時一定要避免與揮發(fā)性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。
⑥ 檢查標本的儲存條件，用已知陽性的標本來同時做陽性對照。
⑦ 檢查色原/底物溶液，zui簡單的檢測方法是將一滴標記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預(yù)期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應(yīng)在一定時間內(nèi)用完，否則會失效。
⑧ 檢查沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉。
⑨ 檢查復(fù)染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。
弱陽性
如果陰性對照沒有染色而陽性對照標本弱陽性，除了考慮上述因素外，還應(yīng)考慮：
① 標本的固定方式，不當?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質(zhì)量。
② 不適當?shù)目乖迯?fù)方式，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復(fù)或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應(yīng)參照生產(chǎn)廠家的說明，同時結(jié)合標本的具體情況而定。
③ 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑生產(chǎn)廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出的使用濃度。
④ 切片上了過多的沖洗液，當抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。
⑤ 孵育時切片是否放置水平，否則會導(dǎo)致抗體流失。如果陰性對照沒有反應(yīng)，陽性對照反應(yīng)良好，而標本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。
免疫組化和western blot驗證蛋白質(zhì)上有什么區(qū)別？
要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？
① 免疫組化可以用來進行定位，但是不能定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進行定量，但是不能定位。
② 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
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