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在我們培養(yǎng) 細(xì)胞系的過程中，對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行傳代是一項(xiàng)常規(guī)的操作，傳代可以幫助我們擴(kuò)大 細(xì)胞系培養(yǎng)的數(shù)量，同時(shí)也避免了因 細(xì)胞系進(jìn)入平臺(tái)期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。今天我們簡單講講傳代操作（主要針對(duì)貼壁細(xì)胞系）。

實(shí)驗(yàn)原理：

當(dāng)培養(yǎng)的 細(xì)胞系增殖達(dá)到一定密度后，將會(huì)出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為 細(xì)胞系的生長和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。貼壁 細(xì)胞系會(huì)在培養(yǎng)瓶中長成致密單層 (懸浮 細(xì)胞系會(huì)充滿整個(gè)體積的培養(yǎng)液)，鋪滿培養(yǎng)瓶底部，此時(shí)如果不及時(shí)進(jìn)行分裝再培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng)， 細(xì)胞系將逐漸走向衰老、死亡，將培養(yǎng)的 細(xì)胞系從一個(gè)容器以適當(dāng)比率轉(zhuǎn)移到其他容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。

首先，我們需要準(zhǔn)備好相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)器材：裝有75%醫(yī)用消毒酒精的酒精噴壺、PBS緩沖液、含血清培養(yǎng)基、巴氏吸管、移液器、離心管、廢液缸。至于其他的超凈臺(tái)、培養(yǎng)箱、離心機(jī)等都是一個(gè) 細(xì)胞系間的基礎(chǔ)設(shè)施。

然后，我們需要把我們準(zhǔn)備的器材放入超凈臺(tái)，打開紫外照射滅菌，值得注意的是若是培養(yǎng)的 細(xì)胞系對(duì)溫度比較敏感，可以將含血清的培養(yǎng)基瓶子（包括盛放的瓶子）放入37℃的水浴箱使得培養(yǎng)基溫度在37℃，再轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)紫外滅菌，當(dāng)然一般的 細(xì)胞系對(duì)培養(yǎng)基的溫度不是很敏感，不用對(duì)培養(yǎng)基加溫也是可以的。另外， 細(xì)胞系培養(yǎng)間也需要紫外照射半小時(shí)左右。

操作步驟：

1、紫外照射滅菌后，我們應(yīng)該穿好滅菌服，戴好滅菌手套和口罩。

2、從培養(yǎng)箱取出 細(xì)胞系培養(yǎng)瓶（一般選擇處于對(duì)數(shù)期的 細(xì)胞系），用酒精噴壺在培養(yǎng)瓶表面噴灑75%酒精消毒，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶到超凈臺(tái)。

3、打開蓋子，輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，用巴氏吸管加入適量PBS緩沖液洗滌1-2次（注意從側(cè)壁加入，以免沖掉 細(xì)胞系），棄去PBS緩沖液。

4、可用移液器加入1-2ml（具體量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定，此處僅為參考用量），“十字"晃動(dòng)，使充分接觸 細(xì)胞系。

5、將加入的 細(xì)胞系培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡載物臺(tái)，鏡下觀察 細(xì)胞系消化情況，當(dāng) 細(xì)胞系變圓且大量脫落時(shí)，準(zhǔn)備終止消化，用75%的酒精噴灑培養(yǎng)瓶表面，轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)。

6、用移液器（或巴氏吸管）加入等量含血清培養(yǎng)基，終止消化。移液器（或巴氏吸管）充分吹打（動(dòng)作也不要太猛，畢竟 細(xì)胞系也是蠻脆弱的），使 細(xì)胞系能夠脫落。

7、將培養(yǎng)瓶中混合液體轉(zhuǎn)移至離心管中（離心管規(guī)格根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定），配平，離心5分鐘左右（離心機(jī)轉(zhuǎn)速根據(jù) 細(xì)胞系種類而定，常見的有1000rpm/min）

8、離心好后，用酒精噴壺噴灑離心管表面，轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈臺(tái)，打開蓋子，將上清液倒入廢液缸。

9、加入適量體積含血清培養(yǎng)基，用移液器或巴氏吸管輕輕吹打，制成 細(xì)胞系懸液。

10、將 細(xì)胞系懸液分裝進(jìn)2個(gè)（或多個(gè)）潔凈滅菌培養(yǎng)瓶，加入適量培養(yǎng)基，蓋好蓋子

1、將分裝好的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡載物臺(tái)，觀察 細(xì)胞系情況， 細(xì)胞系應(yīng)保證一定數(shù)量，數(shù)量太少會(huì)影響生長情況。

12、在培養(yǎng)瓶上做標(biāo)記，注明傳代時(shí)間， 細(xì)胞系種類，操作人員等信息。在放入培養(yǎng)箱之前應(yīng)再次用酒精噴一噴培養(yǎng)瓶表面，然后應(yīng)記得整理操作臺(tái)，用75%酒精擦拭超凈臺(tái)臺(tái)面，清理廢液和垃圾。

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注意 : 全程嚴(yán)格無菌操作！